-
কনফোকল মাইক্রোস্কোপটি এক ধরণের বিশেষ অপটিকাল মাইক্রোস্কোপকে বোঝায় যা অপটিক্যাল স্লাইসগুলি রেকর্ড করতে পারে।
একক বিচ্ছিন্নতা সীমা পয়েন্টটি আলোকিত করে এবং পর্যবেক্ষণ করে, অপটিক্যাল স্লাইসিংটি একটি লেজার কনফোকল সিস্টেমে উপলব্ধি করা হয়। এর জন্য দুটি মরীচি বিভাগের একই ফোকাস রয়েছে, তাই তারা "কনফোকল"। প্রশস্ত ক্ষেত্রের চিত্রগুলির বিপরীতে, কনফোকল চিত্রগুলির কোনও ডিফোকাসিং অস্পষ্টতা নেই। এটি নিজের মধ্যে একটি সুবিধা, কারণ নমুনার গভীর চিত্রটি পরিষ্কার এবং বিশদে সমৃদ্ধ। তবে সর্বাধিক গুরুত্বপূর্ণ সুবিধা হ'ল মাইক্রোস্কোপিক বৈশিষ্ট্যগুলির সাথে এর ত্রি-মাত্রিক ভিজ্যুয়ালাইজেশন সম্ভাবনা। জেড-স্ট্যাকের সাথে চিত্রের ক্রমটি অর্জিত হওয়ার পরে, 3 ডি অবজেক্টটি কম্পিউটার দ্বারা পুনর্গঠন এবং প্রদর্শিত হয়।
- কনফোকল আলোকসজ্জা
পয়েন্ট লাইট সোর্স আলোকসজ্জা একটি ছোট অ্যাপারচার (পিনহোল) এর আলোর উত্সকে ফোকাস করে এবং তারপরে নমুনায় ফোকাস করে উপলব্ধি করা হয়। যখন অ্যাপারচারটি যথেষ্ট ছোট হয়, তখন আলোকসজ্জা বিন্দু কেবল বিচ্ছিন্নতার দ্বারা সীমাবদ্ধ থাকে, আলোর উত্স এবং অ্যাপারচারের জ্যামিতিক পরামিতি দ্বারা নয়। সাধারণ আলোর উত্স একটি বৃহত পৃষ্ঠের আলোর উত্স, সুতরাং এটি বিচ্ছুরণের সীমা স্পটে ফোকাস করা অসম্ভব। সুতরাং, যদিও ট্রান্সমিট্যান্স খুব কম, তবে এই ধরণের ফোকাসযুক্ত আলোকসজ্জা আলো এখনও খুব প্রয়োজনীয় (traditional তিহ্যবাহী আলোর উত্সগুলির জন্য)।
চিত্র 1: কনফোকল ইমেজিংয়ের জন্য আলোকসজ্জা। আলোর উত্স (এলএস) থেকে আলো আলোকসজ্জা পিনহোল (পিআই) এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে এবং তারপরে নমুনা এস প্রবেশ করে ..
আলোর উত্স হিসাবে লেজারের খুব উচ্চ কলিমেশন রয়েছে (একটি ভাল লেজারের আলো "অত্যন্ত সমান্তরাল")। অতএব, লেজারটি পিনহোল ব্যবহার না করে একটি একক লেন্সের মাধ্যমে একটি বিচ্ছুরণ-সীমাবদ্ধ স্পটে ফোকাস করা যেতে পারে। অতএব, বেশিরভাগ কনফোকল মাইক্রোস্কোপগুলির কোনও আলোকসজ্জা পিনহোল নেই। হালকা স্পটের গুণমান লেজারের মরীচি মানের উপর নির্ভর করে। যদি গুণটি ভাল না হয় তবে আপনি আলোক পিনহোলটিও সন্নিবেশ করতে পারেন। লেজারটি সাধারণত অপটিকাল ফাইবারের মাধ্যমে কনফোকল মাইক্রোস্কোপের সাথে মিলিত হয়। এই তন্তুগুলি নিজেরাই পিনহোল হিসাবেও কাজ করে।
লেজারের ফোকালাইজেশন এবং উচ্চ শক্তি ঘনত্ব এটিকে কনফোকল মাইক্রোস্কোপের জন্য একটি আদর্শ আলোর উত্স তৈরি করে। লেজারের সংহতি কনফোকল পারফরম্যান্সের প্রয়োজনীয় বৈশিষ্ট্য নয়। বিপরীতে, এটি অপটিক্যাল ডিজাইনারদের জন্য একটি চ্যালেঞ্জ, কারণ এটি মিথ্যা হস্তক্ষেপের ধরণগুলির কারণ হবে, তাই সাবধানতার সাথে ডিজাইনের কৌশলগুলি প্রয়োজন।
তদতিরিক্ত, traditional তিহ্যবাহী লেজারটি কেবল একটি একক রঙ নির্গত করে (লেজার- "লাইন") এর নিজস্ব সীমাবদ্ধতা রয়েছে। মাল্টি-ফ্লুরোসেন্স ইমেজিং এবং পরিমাপে, জটিল মাল্টি-লেজার বিন্যাস প্রয়োজন। সাদা লেজার দক্ষতার সাথে মাল্টি-কালার ইমেজিংয়ের সমস্যা সমাধান করে।
চিত্র 2: কনফোকল (ডান অঞ্চল) এবং নন-কনফোকাল ইমেজিংয়ের তুলনা। ফিউলজেন দাগযুক্ত মাউস ট্রফোব্লাস্টে। নন-কনফোকাল চিত্রগুলির প্রচুর তথ্য ফোকাল বিমান থেকে আসে না। কনফোকল অপটিক্স সমস্ত অস্পষ্ট কারণগুলি সরিয়ে দেয় এবং কাঠামোটি পরিষ্কার করে তোলে।
কনফোকল সনাক্তকরণ
বেশিরভাগ ডিটেক্টরদের মোটামুটি বৃহত সংবেদনশীল অঞ্চল থাকে (ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউবগুলি সাধারণত বেশ কয়েকটি বর্গ সেন্টিমিটার হয়)। কনফোকল অপটিক্সের পয়েন্ট সেন্সিং দরকার। অতএব, হালকা মরীচিগুলিতে একটি ছোট অ্যাপারচার (পিনহোল) সন্নিবেশ করে স্পট সনাক্তকরণ সম্পাদন করা প্রয়োজন। পিনহোলে নমুনার আলোকে ফোকাস করা, সংক্রমণিত আলো সংগ্রহ এবং রেকর্ডিং।
যেহেতু বিচ্ছিন্নতা প্যাটার্নটি সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার এবং তরঙ্গদৈর্ঘ্যের উপর নির্ভর করে, পিনহোল সনাক্তকরণ প্রয়োজনীয়। অতএব, যখন এই পরামিতিগুলি পরিবর্তিত হয়, পিনহোলের আকার অবশ্যই সামঞ্জস্য করতে হবে।
যখন উদ্দেশ্য লেন্সগুলি পরিবর্তিত হয় (সাধারণত সংখ্যার অ্যাপারচারের পরিবর্তনের সাথে), আধুনিক কনফোকল স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ স্বয়ংক্রিয়ভাবে পিনহোল ব্যাস যথাযথভাবে পরিবর্তন করবে। অতএব, পিনহোলগুলি সাধারণত ডাবল বা মাল্টি-লেয়ার অ্যাপারচার হিসাবে ডিজাইন করা হয়।
প্রকৃতপক্ষে, পিনহোলের উপযুক্ত আকারটি কেবল তরঙ্গদৈর্ঘ্য এবং সংখ্যাসূচক অ্যাপারচারের উপর নির্ভর করে না, মাইক্রোস্কোপে অপটিক্যাল উপাদানগুলির অভ্যন্তরীণ মাত্রায়ও নির্ভর করে।
অতএব, এটি কেবল অনাকাঙ্ক্ষিত নয় তবে বিভিন্ন ডিজাইনের সাথে মাইক্রোস্কোপগুলিতে পিনহোল ব্যাসারগুলি সরাসরি তুলনা করাও ভুল। যদি পিনহোল ব্যাসটি সর্বোত্তম মানটিতে সেট না করা হয় তবে সিস্টেমটি অপটিক্যাল স্লাইসিংটি সহজেই সম্পাদন করতে সক্ষম হবে না (অর্থাৎ ডিফোকাস ব্লার প্রেরণ করে), বা আরও অপটিক্যাল স্লাইসিং গুণমান (ফলস্বরূপ অপ্রয়োজনীয় শব্দের চিত্রগুলির ফলস্বরূপ) না পেয়ে অযথা তীব্রতা কেটে ফেলবে।
চিত্র 3: কনফোকল ইমেজিংয়ে সনাক্তকরণ। নমুনা এস থেকে আলো পর্যবেক্ষণ পিনহোল (পিও) এবং তারপরে ডিটেক্টর ডি -তে মনোনিবেশ করা হয়।
কনফোকল স্ক্যানিংয়ের অপটিক্যাল পথ
কনফোকল স্ক্যানিং সিস্টেমের কনফোকল মরীচি পথটি কেবলমাত্র পয়েন্ট উত্স আলোকসজ্জা এবং পয়েন্ট সনাক্তকরণের সংমিশ্রণ। এই সংমিশ্রণটি একটি অপটিক্যাল ছুরি হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। কেবল ফোকাল বিমান থেকে ফোটনগুলি সেন্সরে প্রেরণ করা যায়। অন্য জায়গা থেকে সমস্ত ফোটন ফিল্টার করা হয়। অপটিক্যাল স্লাইসিং "স্থানিক ফিল্টার" এর মাধ্যমে উপলব্ধি করা হয়।
যেহেতু একটি নির্দিষ্ট সময়ে কেবলমাত্র একটি স্পট "কনফোকল" ইমেজিং প্রদর্শিত হয়, গ্রিড মোডে অবজেক্ট ফিল্ডে স্পটটি সরানোর জন্য একটি স্ক্যানিং ডিভাইস প্রয়োজন। সাধারণত, অপটিক্যাল আয়নাটি স্ক্যানিং মোটরটিতে ইনস্টল করা হয় এবং স্ক্যানিং পদ্ধতিটি কার্যকর করতে ব্যবহৃত হয়। একটি পূর্ণ ফ্রেম (সাধারণত) 1,024 লাইন স্ক্যান করার জন্য প্রয়োজনীয় সময়ে একটি বাধা রয়েছে। একটি উচ্চ-গতির স্ক্যানার (অনুরণন স্ক্যানার) প্রবর্তন করে উন্নতি অর্জন করা হয়েছে যা প্রতি সেকেন্ডে 8, 000 বা আরও বেশি লাইন স্ক্যান করে।
কেবল প্রতিফলিত আলোর মাইক্রোস্কোপ প্রযুক্তির অধীনে একটি ভাল অপটিক্যাল স্লাইস অর্জন করা যেতে পারে। এটি সাম্প্রতিক 20 বছরে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির জোরালো বিকাশের অন্যতম কারণ (অন্যান্য কারণে ইমিউনোস্টেইনিং, ডিএনএ-হাইব্রিডাইজেশন, ফ্লুরোসেন্ট বায়োসেন্সর, কোয়ান্টাম ডটস এবং ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিনের আবিষ্কার) অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।
চিত্র 4: বাম থেকে ডানে: 1। আলোকসজ্জা শঙ্কু কেবল ফোকাল প্লেনে ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জককে উত্তেজিত করে না, তবে এটি উপরে এবং নীচে উত্তেজিত করে। এখানে একটি সবুজ ডাবল শঙ্কু দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা। 2 ... নির্গমন পিনহোল কার্যকরভাবে ফোকাল বিমানের উপরে থেকে নির্গত আলোকে বাধা দেয়। 3। এছাড়াও, ফোকাল বিমানের নীচে থেকে আলো পিনহোলের মধ্য দিয়ে যাবে না। 4। কনফোকল সিস্টেমে, কেবল নমুনা থেকে আলো ডিটেক্টরটিতে পৌঁছে যাবে। পিনহোলগুলি সনাক্তকরণ কার্যকরভাবে অন্য অঞ্চলগুলি থেকে কোনও আলো প্রত্যাখ্যান করবে। অবশেষে, আসল অপটিক্যাল বিভাগটি প্রাপ্ত হয়।
